上海盈湾生物欢迎您 登录 注册
首页 资讯中心 返回

资讯中心

推荐阅读

细胞培养实战经验干货分享 (下)

2021-06-16 阅读次数:1232

 

Q:冷冻管应如何解冻?

A:取出冷冻管后,装入小自封袋后立即放入 37°C 水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在 1-2 分钟内全部融化,并注意冷冻管盖沿不要见水,避免污染。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。

 

Q:细胞冷冻管解冻培养时,是否应马上去除 DMSO

A:除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

 

Q:如何用台盼兰计数活细胞?

A:用无血清培养基把细胞悬液稀释到 2002000 /毫升,在 0.1 毫升的细胞悬液中加入 0.1 毫升的 0.4%的 台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。

 

Q:培养细胞时应使用 5%10%CO2?或根本没有影响?

A:一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+作为 pH 的缓冲系统,而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时 应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO₃含量为每公升 3.7g 时,细胞培养时应使用 10% CO2;当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5g 时,则应使用 5% CO2 培养细胞。

 

Q:DMSO 的等级和无菌过滤的方法?

A:冷冻保存使用的 DMSO 等级应为   Tissue culture grade (SigmaD2650)无菌级别,第一次开瓶后应当立即少量分装于无菌试管中,并保存于室温。避免反复冻融而造成 DMSO裂解释放出有害物质,同时也可减少污染的机会。若要过滤 DMSO,则须使用耐 DMSO Nylon 材质滤膜。

 

Q:细胞冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

A:冷冻管内细胞数目一般为 1x10^6 cells/vial,融合瘤细胞则以5x10^6 cells/vial为宜。

 

Q:支原体污染会对细胞培养有何影响?

A:支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究当中的任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为 mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。

 

Q:当侦测出细胞株有支原体污染时,该如何处理?

A:直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。

 

Q:各种细胞培养用的 dishflask 是否均相同?

A:不同品牌的 dish flask,其所 coating polymer 不同,制造程序亦不同,虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用品牌不同之 dish flask 而有显著之生长差异。

 

Q:购买冷冻管细胞经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形?

A:研究人员在冷冻细胞培养时出现细胞数目太少,大都是因为离心过程操作上的失误,造成细胞的物理性损伤,以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心,应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

 

Q:购买细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?

A:研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:(1)培养基使用错误或培养基品质不佳。(2)血清使用错误或血清的品质不佳。(3)解冻过程错误,冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心。(4)悬浮细胞误认为死细胞。(5)温度使用错误,细胞置于–80°C 太久。

 

Q:收到冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落的原因?

A:冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,是因热胀冷缩物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管在放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

 

Q:Hoechst 33258 Hoechst 33342 都能染核,二者区别是什么?

A:Hoechst33342,也称bisBenzimide H 33342HOE 33342。分子式为C27H28N6O·3HCl·3H2O,分子量为615.99Hoechst 33258,也称bisBenzimide H 33258HOE 33258。分子式为C25H24N6O·3HCl,分子量为533.88两种染料都是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料,对细胞的毒性较低。但是 Hoechst 33342 对细胞的毒性作用更小一些,33258 穿透能力较 33342 弱,染活细胞时容易被"泵出",也就是拒染。所以一般来说 Hoechst 33258 用于细胞固定后再染色,而 hoechst33342 则可以对活细胞直接进行染色。